Увеличение и разрешающая способность светового микроскопа
Микроскоп – сложная оптическая система, позволяющая увеличивать изображение исследуемого объекта с десятки и сотни раз. У всех них есть принцип действия, а также характеристики, от которых зависит сфера работы каждого увеличительного прибора.
Увеличение микроскопа
Работа со световым микроскопом проводится для получения изображения под увеличением. Различают несколько его типов: объектив, окуляр, а также диапазон увеличения. Также у современного оборудования есть и цифровое.
Во сколько раз увеличивает световой микроскоп?
В обычном устройстве установлены две линзы, которые являются короткофокусными. Это окуляр и объектив.
Окуляр – это часть увеличительного прибора, устанавливаемая в окулярный узел, куда непосредственно смотрит исследователь. Его кратность в среднем составляет 10-20, величина этого параметра зависит от марки и вида прибора. Эти элементы могут быть съемные, а могут и быть установлены стационарно.
Как определить увеличение светового микроскопа?
Увеличение изображения, обеспечиваемое световым микроскопом, соответствуют произведению усиления окуляра и объектива. То есть изображение, которое мы видим при увеличении объекта, является совместной работой одного и второго элемента.
Объективы же – это элементы, которые также имеют в совеем составе увеличительные линзы. Данная конструкция закреплена на револьверном блоке, на котором может быть несколько объективов.
Например, если окуляр имеет значение кратности 10, а объектив – 20, то общее увеличение составляет 200 крат. Чтобы добиться необходимого размера, стоит поставить лишь подходящие оптические элементы. Однако, есть и ограничения в этом показателе.
Во сколько раз он увеличивает изображение максимально?
Даже самые современнее и мощные микроскопы не смогут увеличить объект свыше 2000 крат, так как изображение будет просто нечетким, и его визуализация будет невозможна.
Цифровое увеличение же зависит от возможности камеры, а также параметров экрана, на который будет выводиться изображение.
Поле зрения микроскопа
Поле зрения является параметром, характеризующий предельно максимальный диаметром области, который может быть визуализирован человеческим глазом при исследовании через окуляр. Зависит поле зрения от:
Данную величину можно рассчитать в миллиметрах, если исследовать миллиметровую шкалу линейки через микроскоп, при этом поле зрения не зависит от кратности увеличения окуляра.
Диаметр выходного зрачка микроскопа
Для того, чтобы определить такой показатель, как диаметр выходного зрачка, необходимо применение динаметра Рамсдена. Также для измерения такой величины может использоваться диоптрийная трубка со стеклянной шкалой. В фокальной плоскости анной лупы расположена сетка, цена деления которой составляет 0,1 миллиметр.
Разрешающая способность
Важными параметрами для увеличительного оборудования является и разрешающая способность светового микроскопа.
Смыслом определения разрешающая способность светового микроскопа, является возможность оптической системы четко различать две рядом расположенные точки. Это минимальное расстояние, расположенное между двумя точками, различающимися отдельно друг от друга.
Есть пределы разрешения светового микроскопа.
Максимальная разрешающая способность равна 0,25 мкм, это предел разрешающей способности светового микроскопа.
Если не достигнут предел разрешения светового микроскопа, то ее можно увеличить. Это возможно путем увеличения апертуры объектива или уменьшением длины волны света.
Полезное увеличение
Это показатель, который определяет увеличение, способное увидеть глазом исследователя, равное разрешающей способности прибора.
Это означает, что разрешающая способность человеческого глаза равна такому же показателю увелиивающего устройства. Для того, чтобы определить максимальную разрешающую способность объектива, необходимо подобрать от 500 до 1000 крат.
Минимальное полезное увеличение – это числовая апертура, помноженная на 500. Соответственно, максимальное увеличение – это числовая апертура, умноженная на 1000. Использование значений, менее минимальных, не даст возможности использовать разрешающую способность в полном объеме, а работа на больших параметрах не дать более четкого изображения изучаемого объекта.
Какие органоиды можно увидеть в световой микроскоп?
При помощи него можно довольно детально изучить структуру и строение клетки и ее органелл. В стандартный световой микроскоп можно увидеть рибосомы, комплекс Гольджи, который был открыт именно при помощи данного оборудования Камилло Гольджи, ядро, вакуоли, митохондрии, хлоропласт. Также прекрасно визуализируется клеточная стенка.
При выборе такой аппаратуры очень важно понимать ее сферу применения, так как для школьной лаборатории вполне достаточными параметрами обладает обычный световой микроскоп, а для научно-исследовательской, медицинской лаборатории, его мощности будет недостаточно для достижения всех поставленных целей. Среди такой техники можно выделить оптические, электронные, рентгеновские микроскопы, сканирующие оптические микроскопы ближнего поля и другие.
Разрешение и увеличение микроскопа
Согласно определению английского физика Рэлея разрешение оптической системы естьминимальное расстояние между двумя точкамиформируемого ею изображения,пока они еще видны раздельно. Рэлей показал, что максимальное разрешение линзы (т.е. минимальное расстояние dмежду двумя соседними точками изображения) прямо пропорционально длине используемой световой волны l и обратно пропорционально показателю преломления среды n, а также углу раскрытия a:
Рис. 3. Угол раскрытия объектива a
Из формулы Рэлея также следует, что разрешение микроскопа можно повысить тремя способами:
1) уменьшением длины волны l(этот способ реализован в ультрафиолетовом и электронном микроскопах);
2) повышением показателя преломления среды n (иммерсионные объективы);
3) увеличением диаметра линз объектива (т.е увеличением угла a).
Численная апертура объектива NA = n* sin(a/2)характеризует его разрешающую способность вне зависимости от конструкции и применяемой длины волны. Введение усредняющего коэффициента 0.61 отражает тот факт, что максимальное разрешение обеспечивают только краевые лучи с максимальным углом a, тогда как близкие к центральному лучи дают разрешение в два раза ниже (рис 3). NA воздушных объективов всегда меньше 1
(n = 1, sin a
Общее увеличение микроскопа равно произведению увеличения объектива и окуляра. В некоторых микроскопах следует учитывать также увеличение дополнительных линз, встроенных в бинокулярную насадку. В микроскопах, оборудованных телекамерами или цифровыми фотоаппаратами, к оптическому увеличению добавляется еще и электронное масштабирование. Поскольку общее увеличение микроскопа в этом случае будет зависеть от многих факторов, в научных публикациях вместо него принято указывать марку микроскопа, а также увеличение и апертуру используемого объектива (например, Zeiss Axiolab, x100/1.25).
Для определения размеров микрообъектов используется специальный измерительный окуляр (окуляр-микрометр),в котором также имеется шкала. Принцип калибровки заключается в определении цены деления шкалы окуляр-микрометра путем совмещения ее со шкалой
объект-микрометра. Зная цену деления объект-микрометра и число его делений, приходящихся на определенное число делений окуляр-микрометра, можно, разделив первое на второе, получить калибровочный фактор. Умножение калибровочного фактора на результаты измерений
окуляр-микрометром позволит приводить их к абсолютной величине, выраженной в микрометрах. Для повышения точности измерений применяются также усовершенствованные окуляр-микрометры, которые снабжены микрометрическим винтом, передвигающим указатель в поле зрения.
Если микроскоп имеет встроенную телекамеру или цифровой фотоаппарат, его калибровку проводят следующим образом:
1. Устанавливают объект-микрометр в микроскоп таким образом, чтобы его деления занимали строго вертикальное положение.
2. Фокусируют объектив на шкалу объект-микрометра и получают ее цифровой снимок (рис. 4).
3. С помощью программы обработки изображений Scion Image (или аналогичной) получают строго горизонтальный профиль яркости вдоль шкалы.
4. Измеряют число пикселов (элементов растра) в отрезке, соединяющем два достаточно далеко отстоящих друг от друга деления шкалы.
5. Вычисляют калибровочный фактор, разделив длину отрезка (мкм) на измеренное в нем число пикселов.
Рис. 4. Шкала объект-микрометра (слева) и ее профиль яркости (справа).
Объектив х10, цена деления 10 мкм. На шкале дополнительно показана линия профиля яркости. Расстояние между крайними делениями вдоль этой линии составляет 400 мкм или 265 пикселов. Калибровочный фактор равен 1.509 (400/265).
Этот способ калибровки микроскопа проводится быстро и обладает высокой точностью (ошибка менее 1%). Естественно, калибровка должна проводиться для каждого объектива отдельно, даже если они имеют одинаковое номинальное увеличение.
Измерение разрешающей способности микроскопа. Формула Рэлея-Аббе позволяет рассчитать только номинальное (т.е. теоретически ожидаемое) разрешение объектива. Действительное разрешение объектива (и микроскопа в целом) может значительно отличаться от номинального.
Если микроскоп оборудован телекамерой или цифровым фотоаппаратом, измерение его реальной разрешающей способности не представляет большой проблемы. Для этого, однако, необходимо более подробно рассмотреть принцип его работы.
Описанная выше диффракция Френеля в виде концентрических круглых колец (рис. 1) возникает только в том случае, если световая волна обладает полной когерентностью. Обладающая частичной когерентностью система освещения микроскопа будет формировать диффракционую картину без выраженных колец. Более того, из-за неидеальности оптики обратное преобразование Фурье также даст изображение, сглаженное по сравнению с исходным. Следовательно, микроскоп вносит погрешность в процесс формирования изображения, что приводит к снижению его разрешающей способности. Для оценки этой погрешности в микроскопии применяют функцию рассеяния точки (Point Spread Function, PSF) и функцию оптической передачи (Optical Transfer Function, OTF).
PSF OTF
Рис. 5. Функция рассеяния точки (PSF) и функция оптической передачи (OTF). OTF является Фурье-образом PSF.
По существу, PSF представляет собой наблюдаемое в микроскоп изображение круглого отверстия минимального диаметра, которое освещено некогерентным светом, а OTF является его Фурье-образом (рис. 5). Чем меньше PSF (и больше сопряженная с ним OTF), тем выше разрешение. Таким образом, задача измерения разрешающей способности микроскопа сводится к определению его PSF (или OTF).
Существует много различных способов прямой и косвенной оценки величины PSF. Например, ее можно вычислить, если исследовать форму перепадов яркости в окрестностях границ микрообъектов. На практике, однако, наиболее простым и точным способом оценки максимального разрешения микроскопа является анализ его OTF, а не PSF.
Для того чтобы измерить разрешающую способность микроскопа при данном увеличении по OTF, необходимо:
1. Получить цифровую фотографию цитологического препарата.
2. Чтобы была возможность применить быстрый алгоритм преобразования Фурье, вырезать из нее квадратный участок, сторона которого L (в пикселах) равна степени числа 2 (128,256,512 и т. д.).
3. Выполнить прямое преобразование Фурье этого участка с помощью программы Scion Image (или аналогичной) и получить OTF микроскопа.
4. Измерить диаметр OTF (D) в пикселах (рис. 5).
5. Используя полученные параметры L и D, а также размеры ячейки матрицы камеры Cв мкм, увеличение адаптера камеры Maиувеличение объектива Mo,рассчитать максимальное разрешение микроскопа d в нм по формуле:
Рис. 6. Изображение анафазы митоза (256х256) и его Фурье-образ.
Точность данного метода измерения разрешающей способности микроскопа зависит, главным образом, от корректности определения диаметра OTF. Однако, как видно из профиля яркости OTF (рис. 7), ее граница плавно снижается к уровню случайного шума, что затрудняет измерение D.
Один из способов повышения объективности определения диаметра OTF заключается в том, чтобы измерять его (или радиус OTF, который обозначается как HWHM) на половине максимальной яркости сигнала. Оценка разрешения микроскопа при этом будет несколько ниже максимального значения.
Другой способ состоит в использовании специальных препаратов, приготовленных из диатомовых водорослей и содержащих мелкие регулярные структуры на пределе разрешения микроскопа. В этом случае в Фурье-образе появляются контрастные рефлексы, которые значительно облегчают точное измерение диаметра OTF.
PSF и OTF непосредственно связаны с формулой Рэлея-Аббе. В свободном от аберраций микроскопе PSF обладает круговой симметрией и определяется выражением
Дата добавления: 2016-02-10 ; просмотров: 4940 ; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ
6.2. Микроскоп
Микроскоп предназначен для наблюдения мелких объектов с большим увеличением и с большей разрешающей способностью, чем дает лупа. Оптическая система микроскопа состоит из двух частей: объектива и окуляра. Объектив микроскопа образует действительное увеличенное обратное изображение предмета в передней фокальной плоскости окуляра. Окуляр действует как лупа и образует мнимое изображение на расстоянии наилучшего видения (рис. 6.4). По отношению ко всему микроскопу рассматриваемый предмет располагается в передней фокальной плоскости.
Рис. 6.4. Оптическая схема микроскопа.
6.2.1. Увеличение микроскопа
Действие микрообъектива характеризуют его линейным увеличением:
 , | (6.5) |
где 
– фокусное расстояние микрообъектива, 
– расстояние между задним фокусом объектива и передним фокусом окуляра, называемое оптическим интервалом или оптической длиной тубуса.
Изображение, создаваемое объективом микроскопа в передней фокальной плоскости окуляра рассматривается через окуляр, который действует как лупа с видимым увеличением:
 . | (6.6) |
Общее увеличение микроскопа определяется как произведение увеличения объектива на увеличение окуляра:
| (6.7) |
.Если известно фокусное расстояние всего микроскопа, то его видимое увеличение можно определить так же, как и у лупы:
 . | (6.8) |
Как правило, увеличение современных объективов микроскопов стандартизованное и составляет ряд чисел: 10, 20, 40, 60, 90, 100 крат. Увеличения окуляров тоже имеют вполне определенные значения, например 10, 20, 30 крат. Во всех современных микроскопах имеется комплект объективов и окуляров, которые специально рассчитываются и изготавливаются так, что подходят друг к другу, поэтому их можно комбинировать для получения разных увеличений.
6.2.2. Поле зрения микроскопа
Поле зрения микроскопа зависит от углового поля окуляра 
, в пределах которого получается изображение достаточно хорошего качества:
 . | (6.9) |
При данном угловом поле окуляра линейное поле микроскопа в пространстве предметов тем меньше, чем больше его видимое увеличение.
6.2.3. Диаметр выходного зрачка микроскопа
Диаметр выходного зрачка микроскопа вычисляется следующим образом:
 . | (6.10) |
где 
– передняя апертура микроскопа.
Диаметр выходного зрачка микроскопа обычно немного меньше диаметра зрачка глаза (0.5 – 1 мм).
При наблюдении в микроскоп зрачок глаза нужно совмещать с выходным зрачком микроскопа.
6.2.4. Разрешающая способность микроскопа
Одной из важнейших характеристик микроскопа является его разрешающая способность. Согласно дифракционной теории Аббе, линейный предел разрешения микроскопа, то есть минимальное расстояние между точками предмета, которые изображаются как раздельные, зависит от длины волны и числовой апертуры микроскопа:
 . | (6.11) |
Предельно достижимую разрешающую способность оптического микроскопа можно сосчитать, исходя из выражения для апертуры микроскопа (
). Если учесть, что максимально возможное значение синуса угла – единичное (
), то для средней длины волны 
можно вычислить разрешающую способность микроскопа: 
.
Из выражения (6.11) следует, что повысить разрешающую способность микроскопа можно двумя способами: либо увеличивая апертуру объектива, либо уменьшая длину волны света, освещающего препарат.
Иммерсия
Для того чтобы увеличить апертуру объектива, пространство между рассматриваемым предметом и объективом заполняется так называемой иммерсионной жидкостью – прозрачным веществом с показателем преломления больше единицы. В качестве такой жидкости используют воду (
), кедровое масло (
), раствор глицерина и другие вещества. Апертуры иммерсионных объективов большого увеличения достигают величины 
, тогда предельно достижимая разрешающая способность иммерсионного оптического микроскопа составит 
.
Применение ультрафиолетовых лучей
Для увеличения разрешающей способности микроскопа вторым способом применяются ультрафиолетовые лучи, длина волны которых меньше, чем у видимых лучей. При этом должна быть использована специальная оптика, прозрачная для ультрафиолетового света. Поскольку человеческий глаз не воспринимает ультрафиолетовое излучение, необходимо либо прибегнуть к средствам, преобразующим невидимое ультрафиолетовое изображение в видимое, либо фотографировать изображение в ультрафиолетовых лучах. При длине волны 
разрешающая способность микроскопа составит 
.
Кроме повышения разрешающей способности, у метода наблюдения в ультрафиолетовом свете есть и другие преимущества. Обычно живые объекты прозрачны в видимой области спектра, и поэтому перед наблюдением их предварительно окрашивают. Но некоторые объекты (нуклеиновые кислоты, белки) имеют избирательное поглощение в ультрафиолетовой области спектра, благодаря чему они могут быть «видимы» в ультрафиолетовом свете без окрашивания.
6.2.5. Полезное увеличение микроскопа
Глаз наблюдателя сможет воспринимать две точки как раздельные, если угловое расстояние между ними будет не меньше углового предела разрешения глаза. Для того чтобы глаз наблюдателя мог полностью использовать разрешающую способность микроскопа, необходимо иметь соответствующее видимое увеличение.
Полезное увеличение – это видимое увеличение, при котором глаз наблюдателя будет полностью использовать разрешающую способность микроскопа, то есть разрешающая способность микроскопа будет такая же, как и разрешающая способность глаза.
Если две точки в передней фокальной плоскости микроскопа расположены друг от друга на расстоянии 
, то угловое расстояние между изображениями этих точек 
. Из выражений (6.11) и (6.8) можно вывести видимое увеличение микроскопа:
 . | (6.12) |
Поскольку обычно диаметр выходного зрачка микроскопа около 0.5 – 1 мм, угловой предел разрешения глаза 2´ – 4´. Если взять среднюю длину волны в видимой области спектра (0.5 мкм), то для полезного увеличения микроскопа можно вывести зависимость:
 . | (6.13) |
Микроскоп с видимым увеличением меньше 500А не позволяет различать глазом все тонкости структуры предмета, которые изображаются как раздельные данным объективом (
). Использование видимого увеличения больше 1000А нецелесообразно, так как разрешающая способность объектива не позволяет полностью использовать разрешающую способность глаза (
).
